Dopo la perfusione con agenti crioprotettori, il paziente non viene semplicemente immerso nell'azoto liquido.
Il paziente viene raffreddato nell'arco di diversi giorni secondo un programma controllato da computer. I sensori posizionati all'interno del corpo indicano se le diverse regioni anatomiche si raffreddano in modo uniforme o se si creano gradienti termici pericolosi.
Le difficoltà tecniche cambiano man mano che la temperatura diminuisce. Nelle fasi iniziali il raffreddamento deve limitare la formazione di ghiaccio. In prossimità della transizione vetrosa e a temperature inferiori, invece, la precisione del controllo e l'uniformità della temperatura diventano più importanti della velocità di raffreddamento.
Perché il raffreddamento controllato è necessario
Gli agenti crioprotettori riducono la velocità di raffreddamento necessaria per evitare la formazione di ghiaccio: permettono ai tessuti ricchi d'acqua di raggiungere uno stato vetroso molto viscoso, limitando la formazione di cristalli.
La temperatura di transizione vetrosa, indicata con Tg, dipende dalla soluzione, dalla sua concentrazione e dal metodo di misura. Non è una soglia biologica universale, ma un intervallo.
Per le soluzioni usate nella crioconservazione umana, questo intervallo si trova di solito tra −120 °C e −135 °C.
Sopra questa fascia, un raffreddamento troppo lento può favorire la nucleazione e la crescita del ghiaccio. Sotto, il materiale si comporta in modo sempre più simile a un solido fragile.
Se la superficie si raffredda molto più rapidamente del centro, le diverse regioni si contraggono in misura diversa. La tensione termomeccanica che ne risulta può produrre fratture.
Occorre quindi raffreddare abbastanza rapidamente prima della vetrificazione, poi controllare i gradienti termici e la velocità di raffreddamento durante il passaggio dei tessuti allo stato vetroso.
Per approfondire questi passaggi di stato, vedi la differenza tra congelamento e vetrificazione.
La prima generazione di camere di raffreddamento
Il primo sistema di Tomorrow.bio, chiamato V1 cooling box, ha introdotto la configurazione di base per il raffreddamento controllato dell'intero corpo.
Il paziente viene collocato in un'apposita camera termicamente isolata. Un computer controlla l'ambiente criogenico della camera, mentre le termocoppie misurano la temperatura in più punti.
Il sistema di controllo segue una curva programmata, invece di applicare il raffreddamento massimo in modo continuo. Le letture di ciascun sensore vengono registrate per documentare l'andamento della temperatura nel paziente.
La differenza rispetto all'immersione diretta è sostanziale: il sistema può rallentare o sospendere il raffreddamento oppure modificare le condizioni nella camera in base alle temperature rilevate nel paziente.
Il sistema di seconda generazione basato su dewar
Nel sistema di seconda generazione di Tomorrow.bio, il raffreddamento controllato avviene all'interno di un dewar progettato appositamente.
Il paziente resta all'interno del dewar, il cui coperchio è progettato per ospitare l'apparato di raffreddamento, il sistema di controllo computerizzato, le valvole, i collegamenti dei sensori e i passaggi per le termocoppie.
Le termocoppie sono posizionate in più punti all'interno del paziente. Sensori aggiuntivi monitorano l'ambiente termico dentro il dewar.
Il sistema, quindi, non si limita a controllare la temperatura impostata: registra anche la velocità con cui cambia la temperatura nelle diverse regioni del corpo monitorate.
Il computer regola il gradiente di temperatura nel dewar e la velocità di raffreddamento per mantenere i valori rilevati entro i limiti previsti dal protocollo.
Un corpo di grandi dimensioni non può essere perfettamente isotermo durante il raffreddamento. L'obiettivo pratico è ridurre al minimo le differenze di temperatura ed evitare che una regione monitorata si raffreddi troppo rapidamente o troppo lentamente rispetto alle altre.
La geometria del dewar riduce anche la necessità di spostare il paziente nel passaggio dal raffreddamento controllato alla conservazione criogenica: il contenitore chiuso può mantenere condizioni stabili e una distribuzione simmetrica della temperatura attorno al paziente.
La temperatura impostata non è la temperatura del paziente
Un sistema di controllo può raffreddare rapidamente l'ambiente, ma non può portare istantaneamente alla stessa temperatura anche la parte centrale del corpo.
Il calore deve trasferirsi dai tessuti più profondi alla superficie. Il ritardo osservato dipende dalla geometria del corpo, dalla sua composizione, dalla distribuzione degli agenti crioprotettori e dalla posizione dei sensori.
Per questo un solo sensore nella camera non basta: una temperatura nominale dell'ambiente di −130 °C non garantisce che tutti i punti monitorati nel corpo abbiano raggiunto −130 °C.
Il sistema di controllo deve considerare sia la temperatura assoluta sia la differenza tra i canali. Sono utili sia le letture del punto che si raffredda più lentamente e di quello che si raffredda più rapidamente, sia le differenze complessive di temperatura.
Contano anche la calibrazione delle termocoppie, la loro posizione e la continuità del segnale. Le letture anomale e i guasti ai sensori vanno segnalati; i dati inattendibili non devono confluire senza segnalazione nelle medie usate per costruire la curva.
Il programma di raffreddamento a tre fasi di Tomorrow.bio
Il protocollo attuale prevede tre fasi distinte. I valori indicati sono quelli previsti per questa strumentazione e per il metodo di crioprotezione adottato; non sono costanti universali applicabili a qualsiasi sistema di vetrificazione.
1. Discesa rapida verso −130 °C
Nella prima fase, il paziente viene raffreddato dalla temperatura del ghiaccio secco fino a circa −130 °C, alla massima velocità compatibile con differenze di temperatura sicure tra i punti monitorati.
La velocità è importante perché nelle regioni meno protette può ancora formarsi ghiaccio prima che i tessuti passino allo stato vetroso.
Il computer non si basa soltanto sul tempo trascorso: rileva le temperature tramite le termocoppie e regola di conseguenza le condizioni di raffreddamento attorno al paziente.
2. Risalita controllata della temperatura verso −120 °C
Quando la temperatura raggiunge circa −130 °C, si riduce il raffreddamento attivo e si lascia che la temperatura del paziente risalga spontaneamente fino a circa −120 °C.
È la fase di annealing. Vicino alla Tg, il materiale crioprotetto conserva ancora una mobilità molecolare sufficiente a permettere il rilassamento di parte della tensione meccanica accumulata.
La risalita della temperatura permette inoltre di ridurre le differenze termiche tra le regioni più calde e quelle più fredde, prima di raffreddare ulteriormente il materiale allo stato vetroso.
L'annealing non ripara i danni biologici già presenti. Il suo scopo è più circoscritto: ridurre i gradienti termici e le tensioni generate da una contrazione non uniforme.
3. Discesa a −196 °C a circa 1 °C all'ora
A partire da circa −120 °C, il raffreddamento prosegue a una velocità prevista di circa 1 °C all'ora, finché il paziente non raggiunge la temperatura dell'azoto liquido.
Per completare quest'ultimo tratto di raffreddamento di 76 gradi occorrono circa tre giorni, senza contare le pause e gli eventuali interventi di regolazione.
Per mantenere una velocità di raffreddamento di 1 °C all'ora in un corpo di grandi dimensioni e termicamente eterogeneo serve una regolazione continua: non basta impostare la durata del processo.
Il sistema di controllo deve regolare continuamente le condizioni all'interno del dewar, in modo che le temperature rilevate dalle termocoppie interne diminuiscano in modo uniforme, senza gradienti eccessivi.
Quando una regione si raffredda più lentamente, intensificare il raffreddamento dell'ambiente rischia di raffreddarne eccessivamente un'altra. Per regolare con precisione il raffreddamento occorre tenere conto delle letture di tutti i sensori, senza basarsi su un solo valore.
Perché la fase di annealing è scientificamente plausibile
Gli studi sulla vetrificazione di grandi volumi individuano due rischi in diversi intervalli di temperatura: un raffreddamento troppo lento al di sopra della Tg e tensioni meccaniche eccessive in prossimità della Tg e a temperature inferiori.
Uno studio del 2024 sulla vetrificazione di volumi paragonabili a quelli di un organo umano, condotto con più sonde interne, ha concluso che l'annealing riduce i gradienti termici prima che il materiale passi allo stato vetroso.
Lo stesso studio ha rilevato che un raffreddamento lento a temperature inferiori all'intervallo di annealing aiuta a evitare che si formino nuovamente forti gradienti termici e tensioni meccaniche.
Un altro studio sul comportamento termomeccanico ha rilevato che l'annealing in prossimità della Tg modifica sensibilmente le tensioni residue e riduce l'influenza della velocità di raffreddamento adottata nella fase precedente.
Questi studi avvalorano i principi della strategia di controllo, ma non costituiscono una verifica indipendente di ogni singolo valore di temperatura previsto dal protocollo di Tomorrow.bio per il corpo intero.
Un corpo umano intero ha dimensioni maggiori e una struttura più eterogenea rispetto ai campioni di soluzione studiati in laboratorio o ai singoli organi. Resta quindi necessario registrare direttamente le temperature e acquisire immagini dopo il raffreddamento.
Cosa registra il computer
Per valutare il processo non basta il messaggio «raffreddamento completato»: serve la registrazione completa delle temperature rilevate nel tempo da ciascun sensore.
La registrazione deve riportare la velocità di raffreddamento, le pause, le risalite della temperatura, i gradienti termici tra i punti monitorati, gli interventi del sistema di controllo, gli allarmi e le eventuali deviazioni dalla curva programmata.
Questi dati diventano parte della valutazione della qualità della crioconservazione.
Dopo il raffreddamento, una TC eseguita secondo un protocollo standardizzato alla temperatura dell'azoto liquido può mostrare come sono distribuiti gli agenti crioprotettori e rilevare la presenza di ghiaccio, deformazioni evidenti e fratture che i soli dati di temperatura non possono rivelare.
Perché si arriva fino alla temperatura dell'azoto liquido
A pressione atmosferica normale, l'azoto bolle a circa 77,34 kelvin, ovvero circa −195,8 °C, secondo il NIST Chemistry WebBook.
La conservazione in azoto liquido è passiva: finché nel contenitore ne resta a sufficienza, l'equilibrio tra la fase liquida e quella gassosa mantiene stabile la temperatura criogenica senza bisogno di refrigerazione meccanica.
Il raffreddamento controllato termina soltanto quando le temperature rilevate nel paziente consentono il passaggio alla conservazione a temperatura stabile. La conservazione non sostituisce mai la fase di raffreddamento controllato.
Le soluzioni progettuali e i compromessi tecnici della fase successiva sono illustrati nell'approfondimento sui dewar criogenici moderni e sulla conservazione a temperatura intermedia.
In sintesi: Tomorrow.bio utilizza un raffreddamento controllato da computer e sensori di temperatura interni. Il processo prevede un raffreddamento rapido fino in prossimità della transizione vetrosa, una fase di riduzione delle tensioni termiche e infine un raffreddamento lento fino a −196 °C.
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