Vitrifikation war keine einzelne Erfindung. Sie entstand, weil Forscher unterschiedliche Probleme bei der Konservierung von Zellen, Embryonen und Organen und schließlich auch bei der Biostase des Menschen lösten.
Das Ziel klingt einfach: wasserreiches Gewebe so weit abzukühlen, dass es in einen glasartigen Zustand übergeht, ohne dass schädliches Eis entsteht.
Die Umsetzung ist es nicht. Kryoprotektiva können toxisch wirken. Beim Einbringen der Kryoprotektiva kann sich das Zellvolumen verändern. Große Proben kühlen ungleichmäßig ab und lassen sich wesentlich schwerer wieder erwärmen; dabei können mechanische Spannungen entstehen.
Moderne Verfahren erfordern deshalb mehr als die richtige Zusammensetzung der Lösung. Wie gut sie funktionieren, hängt vom Zusammenspiel der chemischen Zusammensetzung, der Perfusion, des Temperaturverlaufs, der zeitlichen Abläufe, der Probengeometrie und der Messtechnik ab.
Vor der Vitrifikation: zusätzliche Schäden durch Kälte
Frühe Kryokonservierung bedeutete meist Einfrieren. Die Kühlung verlangsamte chemische Prozesse, doch Wasser kristallisierte zu Eis.
Eis drängt Salze und andere gelöste Stoffe in die verbleibende Flüssigkeit ab. Dabei werden Zellen mechanisch verformt, hohen Konzentrationen gelöster Stoffe ausgesetzt und entwässert; zudem können ihre Membranen Schaden nehmen.
Schnelleres Abkühlen kann das Wachstum der Kristalle begrenzen. Ohne schützende Zusätze geht Wasser jedoch nur bei extrem hohen Kühlraten in einen glasartigen Zustand über. Das funktioniert nur bei extrem dünnen Proben.
Das historische Problem bestand nicht nur darin, eine niedrige Temperatur zu erreichen. Es bestand darin, sie zu erreichen, ohne dass sich Wasser zu schädlichen Kristallen ordnet.
1937 bis 1938: die ersten kinetischen Vitrifikationsexperimente
Basile Luyet schlug Vitrifikation 1937 als Strategie zur biologischen Konservierung vor.
1938 berichteten Luyet und Eugene Hodapp, dass Froschspermien nach Austrocknung mit konzentrierter Saccharose ihre Beweglichkeit zurückgewannen, nachdem sie flüssiger Luft ausgesetzt worden waren.
Das ursprüngliche Experiment beruhte auf mikroskopisch dünnen Filmen und extremer Kühlgeschwindigkeit. Es zeigte, dass Vitrifikation physikalisch möglich ist, lieferte aber noch kein Verfahren, das sich auf Organe übertragen ließ.
Dieser Ansatz heißt heute kinetische Vitrifikation: Der Probe wird so schnell Wärme entzogen, dass sich keine Eiskeime bilden und keine Eiskristalle wachsen können.
An der Größe scheitert dieser Ansatz. Mit zunehmender Probengröße wächst das Volumen stärker als die Oberfläche. Deshalb kühlt das Innere einer großen Probe wesentlich langsamer ab als ihre Oberfläche.
1949: Glycerin eröffnet neue Möglichkeiten
Christopher Polge, Audrey Smith und Alan Parkes entdeckten 1949, dass Glycerin Spermien beim Einfrieren schützen kann.
Ihr Bericht in Nature begründete die praktische Bedeutung von zellpenetrierenden Kryoprotektiva.
Diese Moleküle dringen in Zellen ein, binden Wasser und verringern die Eismenge, die sich bei einer bestimmten Temperatur bildet. Zudem begrenzen sie beim Einfrieren den schädlichen Anstieg der Konzentration gelöster Stoffe.
Die Entdeckung veränderte die Kryobiologie grundlegend, denn die Kühlrate war nicht mehr die einzige Stellgröße. Die chemische Zusammensetzung konnte das Phasenverhalten von Wasser selbst verändern.
Sie schuf zugleich ein neues Optimierungsproblem. Eine höhere Konzentration des Kryoprotektivums verhindert die Eisbildung wirksamer, kann aber stärkere chemische und osmotische Schäden verursachen.
1959 bis 1968: mehr Wirkstoffe und stufenweise Beladung
1959 berichteten James Lovelock und Marcus Bishop, dass Dimethylsulfoxid mehrere Zelltypen vor Gefrierschäden schützte.
DMSO durchdrang manche Membranen leichter als Glycerin. Damit ließen sich weitere Zelltypen vor Gefrierschäden schützen; bis heute wird DMSO in Labor und Klinik häufig eingesetzt.
John Farrant untersuchte anschließend, wie sich die Konzentration des Kryoprotektivums bei gleichzeitig sinkender Temperatur erhöhen ließ, sodass das Gewebe in einer konzentrierten, flüssigen Lösung blieb, ohne gezielt eine Eisbildung auszulösen.
Damit nahm er ein zentrales Merkmal moderner Protokolle vorweg: Kryoprotektivum stufenweise bei niedriger Temperatur einbringen, statt warmes Gewebe sofort der vollen Konzentration auszusetzen.
Stufenweise Beladung begrenzt den osmotischen Schock. Bei niedrigeren Temperaturen laufen viele chemische Reaktionen langsamer ab, sodass das Gewebe eine sonst schädliche Behandlung besser verträgt.
1968 zeigten Experimente, dass sich rote Blutkörperchen bei ausreichend hoher Glycerinkonzentration auf die Temperatur von flüssigem Stickstoff abkühlen ließen, ohne dass sichtbares Eis entstand.
Damit waren die wesentlichen Grundlagen bekannt. Es fehlte noch ein praktischer Weg, sie auf komplexes, durchblutetes Gewebe anzuwenden.
1984: Vitrifikation als Verfahren zur Organkonservierung
Die 1984 erschienene Arbeit „Vitrification as an Approach to Cryopreservation“ stellte die Vitrifikation als ernst zu nehmenden Ansatz für die langfristige Lagerung von Organen vor.
Die Strategie wurde teils Gleichgewichtsvitrifikation genannt. Eine ausreichend hohe Konzentration des Kryoprotektivums sollte die erforderliche Kühlrate so weit senken, dass sie auch bei größeren Proben technisch erreichbar wäre.
Daraus ergaben sich drei miteinander verknüpfte Voraussetzungen:
- Die Lösung muss bei technisch erreichbaren Kühl- und Erwärmungsraten eisfrei bleiben.
- Das Organ muss sowohl das Einbringen als auch das anschließende Auswaschen der Lösung vertragen.
- Das Kryoprotektivum muss jede Region erreichen, bevor die Kühlung beginnt.
Eine Lösung konnte im Reagenzglas hervorragend funktionieren und sich dennoch für ein Organ als ungeeignet erweisen, etwa wegen des Gefäßwiderstands, langer Diffusionswege oder toxischer Wirkungen.
1985: lebende Embryonen kehren aus dem Glaszustand zurück
William Rall und Gregory Fahy berichteten 1985 über die eisfreie Kryokonservierung von Mausembryonen bei −196 °C.
Damit war ein entscheidender biologischer Nachweis erbracht. Lebende kernhaltige Säugetierzellen konnten vollständig vitrifiziert werden und die anschließende Wiedererwärmung überleben.
Embryonen sind allerdings sehr klein. Temperatur und Kryoprotektivumkonzentration lassen sich in ihnen schneller und gleichmäßiger verändern als in einem Organ eines ausgewachsenen Tieres.
Das Ergebnis bestätigte die Methode und machte zugleich das Größenproblem deutlicher sichtbar.
Mit zunehmender Größe treten vier Probleme auf
1. Toxizität der Kryoprotektiva
Die für die Vitrifikation nötige Konzentration kann Proteine, Membranen und den Zellstoffwechsel schädigen. Die Toxizität hängt von Wirkstoff, Konzentration, Temperatur, Einwirkzeit und Gewebeart ab.
Wie toxisch eine Behandlung wirkt, hängt also nicht allein vom verwendeten Molekül ab. Entscheidend ist auch, wie das Kryoprotektivum eingebracht und wieder ausgewaschen wird.
2. Osmotischer Stress
Konzentrierte Lösung zieht Wasser aus den Zellen. Wird sie entfernt, kann Wasser zu schnell zurückströmen.
Moderne Protokolle nutzen Konzentrationsrampen, Trägerlösungen, Temperaturkontrolle und nicht penetrierende gelöste Stoffe, um Volumenänderungen in einem verträglichen Rahmen zu halten.
3. Ungleichmäßige Verteilung
In einem Organ lässt sich eine Lösung nicht so gleichmäßig verteilen wie in einem Behälter. Das Kryoprotektivum wandert durch Gefäße, durchdringt Kapillarwände und diffundiert durch Gewebe.
Gerinnsel, Ödeme, Gefäßerkrankungen, Ischämie und die Blut-Hirn-Schranke können verhindern, dass in allen Geweberegionen die zur Vermeidung von Eisbildung nötige Konzentration erreicht wird.
Deshalb werden bei modernen Perfusion Verfahren Druck, Durchfluss, Temperatur und die Konzentration des Kryoprotektivums im venösen Abfluss gemessen; das zugeführte Lösungsvolumen allein reicht zur Beurteilung nicht aus.
4. Thermische Gradienten
Ein großes Objekt kühlt von außen nach innen ab. Bei ungleichmäßiger Abkühlung ziehen sich die einzelnen Bereiche unterschiedlich stark zusammen.
Nahe und unterhalb des Glasübergangs kann das Material Spannungen nicht schnell abbauen. Übersteigt die Spannung die mechanische Festigkeit, können Risse entstehen.
Abhilfe schufen kontrollierte Kühlraten, Tempern nahe der Glasübergangstemperatur T_g und langsameres Abkühlen im Bereich des Glasübergangs. Diese Prinzipien prägen heute die computergesteuerte Abkühlung beim Menschen.
1990er und 2000er Jahre: Wirkstoffmischungen setzen sich durch
Kein einzelnes Kryoprotektivum erfüllte alle Anforderungen zugleich. Forscher kombinierten zunehmend zellgängige Wirkstoffe, um die schützende Wirkung zu erzielen, ohne einzelne Substanzen in stark schädigenden Konzentrationen einsetzen zu müssen.
Mithilfe von Trägerlösungen ließen sich die Ionenzusammensetzung, der pH-Wert und die osmotischen Bedingungen einstellen. Polymere, die nicht in die Zellen eindringen, beeinflussten den Wasserhaushalt des Gewebes und die Eigenschaften der Gefäße.
Synthetische Eisblocker hemmten die heterogene Eiskeimbildung und das Wachstum von Eiskristallen. Dadurch war die Vermeidung von Eisbildung weniger stark von der Konzentration der Kryoprotektiva allein abhängig.
Bei Lösungen wie VS55 und später M22 wurden mehrere Wirkstoffe, Eisblocker und sorgfältig abgestimmte Trägerlösungen mit festgelegten Perfusionsabläufen und Temperaturverläufen kombiniert.
Ein Übersichtsartikel zur Organvitrifikation aus dem Jahr 2004 beschreibt Fortschritte bei der Verringerung toxischer Wirkungen und von Kälteschäden, bei der Kontrolle der Eiskeimbildung und bei der Organperfusion.
Der entscheidende Fortschritt bestand nicht darin, dass die Toxizität verschwand. Forscher lernten, die Belastung durch eine abgestimmte Wahl der chemischen Zusammensetzung, der Einwirkdauer und der Temperatur zu begrenzen.
Kaninchennieren-Experimente: wichtig und leicht zu überschätzen
Versuche an Kaninchennieren zeigten, dass sich ein durchblutetes Säugetierorgan mit einer komplexen Vitrifikationslösung perfundieren, in einen glasartigen Zustand abkühlen, wieder erwärmen und transplantieren ließ.
In einem beschriebenen Versuch übernahm die transplantierte Niere über einen längeren Zeitraum als einzige funktionsfähige Niere die Nierenfunktion des Kaninchens.
Das Ergebnis ist bedeutsam, weil es über Versuche mit mikroskopischen Proben hinausging und die Funktion eines ganzen Organs nachwies. Es begründete jedoch kein verlässliches klinisches Verfahren.
Die spätere Fachliteratur hält fest, dass langfristiger Transplantationserfolg nicht reproduzierbar erreicht wurde. Die ungleichmäßige Verteilung, toxische Wirkungen und die herkömmliche Erwärmung über die Oberfläche begrenzten weiterhin den Erfolg.
Damit liegt ein bedeutender Machbarkeitsnachweis vor; die Reproduzierbarkeit und die Übertragbarkeit auf größere Organe bleiben jedoch ungelöst.
2015: Erhaltungsqualität wird auf synaptischer Ebene sichtbar
Aldehydstabilisierte Kryokonservierung verband chemische Fixierung, Perfusion mit Kryoprotektivum und Vitrifikation in Kaninchen- und Schweinehirnen.
Die Studie von 2015 zeigte, dass Membranen, Synapsen, Vesikel, Myelin und intrazelluläre Strukturen nach der Wiedererwärmung und Präparation für die Elektronenmikroskopie klar erkennbar waren.
Sie zeigte, dass die neuronale Feinstruktur auch in großen Gehirnen nach eisfreier Lagerung und Wiedererwärmung sehr gut erhalten sein kann.
Eine Wiederherstellung der Lebensfähigkeit des Gewebes wurde damit nicht nachgewiesen. Bei der Aldehydfixierung wird biologisches Material gezielt chemisch vernetzt; eine Wiederherstellung der Lebensfunktionen ist danach mit herkömmlichen Verfahren nicht möglich.
Das Experiment zeigte somit, wie gut die Gewebestruktur erhalten blieb; ob eine Wiederbelebung möglich wäre, beantwortete es nicht.
Methodisch war das Experiment besonders bedeutsam: Wie gut eine Probe erhalten ist, sollte direkt an den relevanten Strukturen untersucht werden; ihr glasiges Aussehen allein reicht als Kriterium nicht aus.
2023: Nanowarming löst das Erwärmungsproblem bei Rattennieren
Für eine reversible Kryokonservierung reicht es nicht aus, das Gewebe unbeschadet abzukühlen. Die Wiedererwärmung ist oft schwieriger.
Wird das Gewebe zu langsam erwärmt, können sich beim Übergang aus dem glasartigen Zustand Eiskristalle bilden und wachsen. Kommt die Wärme hauptsächlich von der Oberfläche, können thermische Gradienten das Organ zerreißen.
Nanowarming löst beide Probleme, indem Eisenoxid-Nanopartikel im Gefäßsystem verteilt und mit einem wechselnden Hochfrequenz-Magnetfeld erwärmt werden.
2023 haben Forscher Rattennieren vitrifiziert, bis zu 100 Tage gelagert, per Nanowarming erwärmt und transplantiert.
Bei Empfängertieren ohne eigene Nieren übernahmen die transplantierten Organe im beschriebenen Nachbeobachtungszeitraum die lebensnotwendige Nierenfunktion.
Der Erfolg beruhte auf mehr als der Erwärmung. Das Team verwendete eine weniger toxische Lösung und modellierte das Einbringen des Kryoprotektivums, um dessen Konzentration im Gewebe gezielter einzustellen.
Das zeigt sich in der Geschichte der Vitrifikation immer wieder: Sobald ein Problem gelöst ist, wird das nächste erkennbar. Damit das Gewebe seine Funktion zurückgewinnt, müssen alle Verfahrensschritte aufeinander abgestimmt sein.
2024 bis 2026: größere physikalische Systeme und funktionsfähiges Nervengewebe
2024 berichteten Forscher über physikalische Vitrifikation im Maßstab menschlicher Organe in Systemen von 0,5 bis 3 Litern.
Sie kombinierten interne Temperaturmessung, Temperung, kontrollierte Kühlung und Mikro-CT-Untersuchung. Zudem zeigten sie Nanowarming in Volumina bis zu 2 Litern.
Die Versuche mit den größten Volumina dienten vor allem dem Nachweis der physikalischen Machbarkeit. Sichtbares Eis und Risse müssen zwar vermieden werden. Das allein belegt jedoch nicht, dass ein Organ von der Größe eines menschlichen Organs seine biologische Funktion zurückgewinnen kann.
2026 berichtete eine PNAS-Studie, dass Hippocampusgewebe erwachsener Mäuse nach Vitrifikation und Wiedererwärmung kurzfristig wieder funktionsfähig war.
Die Studie erfasste Morphologie, mitochondriale Reaktionsfähigkeit, neuronale Erregbarkeit, synaptische Übertragung und Langzeitpotenzierung.
Untersucht wurden Hirnschnitte von Mäusen sowie Ganzhirnpräparate, bei denen die Ausbeute gering war; menschliche Gehirne wurden nicht untersucht. Die Aussagekraft der Studie ist damit begrenzt, das Ergebnis bleibt jedoch bedeutsam.
Sie zeigte, dass Nervengewebe erwachsener Säugetiere nach einem Aufenthalt im glasartigen Zustand, in dem die molekulare Beweglichkeit stark eingeschränkt ist, wieder elektrophysiologisch aktiv werden kann.
Bei der Biostase des Menschen sind die Bedingungen schwieriger
Bei Experimenten zur langfristigen Organkonservierung stehen gesundes Gewebe, genau festgelegte zeitliche Abläufe und ein vorbereiteter Gefäßzugang zur Verfügung.
Die Biostase des Menschen beginnt nach der ärztlichen Feststellung des Todes. Krankheit, warme Ischämie, Gerinnung, Ödeme, Transport und Gefäßerkrankungen können die Verteilung des Kryoprotektivums allesamt beeinträchtigen.
Das unmittelbare Ziel ist, die Gewebestruktur für eine mögliche künftige Reparatur zu erhalten; eine Konservierung, die sich schon heute für eine anschließende Transplantation rückgängig machen ließe, ist damit nicht gemeint.
Dieser Unterschied ist der Grund, warum sich Laborergebnisse nicht unmittelbar auf Aussagen über Patienten übertragen lassen.
Wie Tomorrow.bio die Vitrifikation für den Einsatz vor Ort anpasste
Tomorrow.bio verlegte die kryoprotektive Ganzkörperperfusion in speziell ausgerüstete Rettungswagen. Die Behandlung kann in der Nähe des Patienten beginnen, noch bevor er in die Schweiz transportiert wird.
Dadurch verkürzt sich die Ischämie vor Beginn der Perfusion, deren Folgen sich durch die chemische Zusammensetzung der Lösung nicht nachträglich ausgleichen lassen.
Das aktuelle Protokoll sieht eine Lösung auf VM-1-Basis vor, die für die Kryoprotektion vor Ort und den anschließenden Transport auf Trockeneis angepasst wurde.
Ein Forschungsprogramm der EBF hat VM-1 unter simulierten postmortalen Bedingungen getestet, darunter drei Stunden warme Ischämie.
Im Rahmen des Programms wurden Änderungen am Perfusat und am Verfahren untersucht. Dabei erfasste das Team den Brechungsindex im venösen Abfluss, die Perfusionsdauer, Gewichtsveränderungen, das Ausmaß der Hirnschrumpfung und die Eisbildung.
Bei der Anwendung am Menschen entscheidet daher nicht allein, ob eine Lösung unter idealen Bedingungen vitrifiziert, sondern vor allem, wie gut sich der Körper nach einer Ischämie perfundieren lässt.
Messung wurde Teil des Verfahrens
In der frühen Vitrifikationsforschung wurde der Erfolg häufig anhand der Transparenz der Proben, durch Kalorimetrie und Röntgenbeugung oder anhand des Überlebens beziehungsweise der Funktion nach der Wiedererwärmung beurteilt.
Bei der Biostase des Menschen lässt sich der Erfolg heute nicht daran messen, ob die Lebensfunktionen wiederhergestellt werden können. Die Erhaltungsqualität muss deshalb mit zerstörungsfreien Untersuchungen und anhand von Gewebeproben beurteilt werden.
Tomorrow.bio untersucht jeden Patienten mittels CT bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff, um unter standardisierten Bedingungen die Verteilung des Kryoprotektivums abzuschätzen und Eis oder makroskopische Defekte zu erkennen.
Mit gesonderter Einwilligung können winzige Proben von Nervengewebe entnommen werden, um Membranen, Synapsen und die lokale Feinstruktur elektronenmikroskopisch zu beurteilen.
Diese Methoden und ihre Grenzen werden im Beitrag „Verfahren zur Qualitätskontrolle in der Biostase“ beschrieben.biostasis quality-check procedures.
Solche Messungen helfen auch dabei, die Verfahren weiterzuentwickeln. Lassen sich Schäden erkennen und zwischen verschiedenen Fällen vergleichen, können die chemische Zusammensetzung und der Verfahrensablauf gezielt angepasst werden.
Was sich verbessert hat und was noch ungelöst ist
Moderne Vitrifikation hat mehrere Dinge erreicht, die frühes Einfrieren nicht leisten konnte:
- Eisfreie Erhaltung vieler Zellen, Embryonen und kleiner Gewebeproben.
- Wiederherstellung der Funktion vitrifizierter Tierorgane unter festgelegten Versuchsbedingungen.
- Strukturelle Erhaltung bis auf synaptische Ebene in fixierten Säugetiergehirnen.
- Computergesteuerte Kühlung und Temperung größerer Systeme.
- Volumetrische Wiedererwärmung durch Verfahren wie Nanowarming.
- Untersuchung der tatsächlich erhaltenen Gewebestrukturen mittels CT und Elektronenmikroskopie.
Eine reversible Kryokonservierung des gesamten menschlichen Körpers ist bislang nicht gelungen.
Zu den offenen Problemen zählen postmortale Ischämie, ungleichmäßige Perfusion, Toxizität der Kryoprotektiva, Effekte der Blut-Hirn-Schranke, thermische Gradienten im gesamten Körper, Rissvermeidung und eine sichere, gleichmäßige Wiedererwärmung.
Selbst wenn die Gewebestruktur erfolgreich erhalten bliebe, wäre weiterhin ungeklärt, wie sich Schäden reparieren, der Mensch wiederbeleben und die zum Tod führende Erkrankung oder Verletzung behandeln ließen.
Diese Unterschiede werden im Beitrag „Technische Herausforderungen der reversiblen Kryokonservierung“ näher erläutert.technical challenges for reversible cryopreservation.
Kurz gesagt: Die Vitrifikation wurde durch Fortschritte bei Kryoprotektiva, Perfusion, der Vermeidung von Eisbildung, Kühlung, Wiedererwärmung und der Untersuchung der Gewebestruktur weiterentwickelt. Bei kleinen Proben sind manche Probleme bereits gelöst. Wie sich die Kryokonservierung eines ganzen Menschen rückgängig machen ließe, ist dagegen weiterhin offen.
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