La vitrificazione non è stata un'unica invenzione. È emersa mano a mano che i ricercatori risolvevano una serie di problemi diversi, su cellule, embrioni, organi e, infine, sulla biostasi umana.
L'obiettivo sembra semplice: raffreddare un tessuto ricco d'acqua fino a farlo diventare vetro, senza che si formi ghiaccio dannoso.
Metterlo in pratica non è semplice. Gli agenti crioprotettori possono essere tossici. Il loro caricamento può alterare le cellule. Gli oggetti di grandi dimensioni si raffreddano in modo disomogeneo, accumulano tensioni meccaniche e sono molto più difficili da riscaldare.
Le procedure moderne sono quindi sistemi, non ricette. La loro qualità dipende dal funzionamento congiunto di chimica, perfusione, temperatura, tempistica, geometria e misurazione.
Prima della vitrificazione: il freddo come seconda lesione
La crioconservazione delle origini consisteva perlopiù nel congelamento. Il raffreddamento rallentava la chimica cellulare, ma l'acqua cristallizzava in ghiaccio.
Il ghiaccio espelle sali e altri soluti nel liquido rimasto. Le cellule possono così subire, insieme, spostamenti meccanici, concentrazioni estreme di soluti, disidratazione e danni alle membrane.
Raffreddare più in fretta può rendere i cristalli più piccoli, ma l'acqua comune richiede velocità straordinarie per diventare vetro senza l'aiuto della chimica, e questo funziona solo su campioni estremamente sottili.
Il problema storico non era soltanto raggiungere una temperatura bassa. Era raggiungerla senza lasciare che l'acqua si riorganizzasse in cristalli dannosi.
1937-1938: i primi esperimenti di vitrificazione cinetica
Basile Luyet propose la vitrificazione come strategia di conservazione biologica nel 1937.
Nel 1938, Luyet ed Eugene Hodapp riportarono il recupero della motilità in spermatozoi di rana esposti ad aria liquida dopo disidratazione con saccarosio concentrato.
L'esperimento originale si basava su pellicole microscopiche e su una velocità di raffreddamento estrema. Dimostrava una possibilità fisica, non un protocollo applicabile a un organo su scala reale.
Questo approccio è oggi chiamato vitrificazione cinetica: superare in velocità la cristallizzazione, sottraendo calore più rapidamente di quanto il ghiaccio riesca a nucleare e crescere.
È la scala a renderlo impraticabile. La superficie cresce più lentamente del volume, e il centro di un campione grande non riesce a seguire la superficie con la stessa rapidità.
1949: il glicerolo cambia il problema
Christopher Polge, Audrey Smith e Alan Parkes scoprirono nel 1949 che il glicerolo poteva proteggere gli spermatozoi durante la conservazione a bassa temperatura.
Il loro articolo su Nature stabilì l'importanza pratica degli agenti crioprotettori penetranti.
Queste molecole entrano nelle cellule, legano l'acqua e riducono la quantità di ghiaccio che si forma a una data temperatura. Riducono inoltre la concentrazione dannosa di soluti durante il congelamento.
La scoperta trasformò la criobiologia perché la velocità di raffreddamento non era più l'unica variabile di controllo: la composizione chimica poteva modificare il comportamento di fase dell'acqua.
Introdusse anche un nuovo problema di ottimizzazione. Più agente crioprotettore sopprime il ghiaccio in modo più efficace, ma aumenta il danno chimico e osmotico.
1959-1968: più agenti e caricamento graduale
Nel 1959, James Lovelock e Marcus Bishop riportarono che il dimetilsolfossido proteggeva diversi tipi di cellule dal danno da congelamento.
Il DMSO attraversava alcune membrane più facilmente del glicerolo. Ampliò la gamma di cellule crioconservabili e resta oggi molto usato nella crioconservazione di laboratorio e clinica.
John Farrant esplorò poi l'aumento della concentrazione dell'agente crioprotettore insieme all'abbassamento della temperatura, mantenendo il tessuto in un liquido concentrato senza formare deliberatamente ghiaccio.
Questo anticipava una caratteristica fondamentale dei protocolli moderni: caricare l'agente crioprotettore per gradi, a bassa temperatura, invece di esporre il tessuto caldo alla concentrazione piena in un solo passaggio.
Il caricamento graduale limita lo shock osmotico. Una temperatura più bassa riduce molte velocità di reazione chimica e può rendere più tollerabile un'esposizione altrimenti dannosa.
Nel 1968, alcuni esperimenti mostrarono che i globuli rossi potevano raggiungere la temperatura dell'azoto liquido senza ghiaccio visibile, a concentrazioni di glicerolo sufficientemente elevate.
Gli elementi concettuali c'erano già tutti. Mancava un modo pratico per applicarli a un tessuto complesso e vascolarizzato.
1984: la vitrificazione diventa una strategia per gli organi
L'articolo del 1984 «Vitrification as an Approach to Cryopreservation» ridefinì la vitrificazione come una via seria verso la conservazione degli organi.
La strategia fu talvolta chiamata vitrificazione all'equilibrio. Invece di richiedere una velocità di raffreddamento impossibile, si usa abbastanza agente crioprotettore da rendere raggiungibile la velocità critica di raffreddamento anche in un sistema più grande.
Questo cambiamento fece emergere tre vincoli collegati tra loro:
- la soluzione deve resistere alla formazione di ghiaccio a velocità di raffreddamento e riscaldamento raggiungibili nella pratica;
- l'organo deve tollerare il caricamento e lo scaricamento di quella soluzione;
- l'agente crioprotettore deve raggiungere ogni regione prima che inizi il raffreddamento.
Una formulazione poteva funzionare perfettamente in provetta e fallire in un organo, perché la resistenza vascolare, la distanza di diffusione o la tossicità cambiavano il risultato.
1985: embrioni vivi tornano da uno stato vetroso
William Rall e Gregory Fahy riportarono nel 1985 la crioconservazione senza ghiaccio di embrioni di topo a −196 °C.
Fu una dimostrazione biologica decisiva. Cellule di mammifero nucleate e vive potevano sopravvivere al raffreddamento e al riscaldamento attraverso uno stato completamente vetrificato.
Gli embrioni restano però minuscoli. La loro temperatura e la loro concentrazione possono cambiare in modo rapido e uniforme, a differenza di quanto avviene in un organo adulto.
Il risultato convalidò il metodo, rendendo al tempo stesso più visibile il problema della scala.
Il problema della scala si divide in quattro problemi
1. Tossicità dell'agente crioprotettore
La concentrazione necessaria per la vitrificazione può danneggiare proteine, membrane e metabolismo cellulare. La tossicità dipende dall'agente, dalla concentrazione, dalla temperatura, dal tempo di esposizione e dal tipo di tessuto.
Questo significa che «meno tossico» non è una proprietà di una singola molecola presa da sola, ma dell'intero protocollo di caricamento e scaricamento.
2. Stress osmotico
Aggiungere una soluzione concentrata fa uscire acqua dalle cellule. Rimuoverla può far rientrare l'acqua troppo velocemente.
I protocolli moderni usano rampe di concentrazione, soluzioni veicolo, controllo della temperatura e soluti non penetranti per mantenere le variazioni di volume entro limiti tollerabili.
3. Distribuzione disomogenea
Un organo non è un contenitore di liquido uniforme. L'agente crioprotettore viaggia attraverso i vasi, attraversa le pareti dei capillari e si diffonde nel tessuto.
Coaguli, edema, malattie vascolari, ischemia e barriera emato-encefalica possono lasciare alcune regioni al di sotto della concentrazione necessaria a sopprimere il ghiaccio.
Per questo la perfusione moderna misura pressione, flusso, temperatura e concentrazione venosa, invece di affidarsi soltanto al volume di soluzione infuso.
4. Gradienti termici
Un oggetto di grandi dimensioni si raffredda dall'esterno verso l'interno. Temperature diverse producono velocità di contrazione diverse.
In prossimità della transizione vetrosa e al di sotto di essa, il materiale non riesce a rilassare rapidamente le tensioni meccaniche. Se la tensione supera la resistenza del materiale, possono formarsi fratture.
La soluzione è stata un raffreddamento a velocità controllata, con un annealing vicino a Tg e una discesa più lenta attraverso la regione vetrosa. Questi principi guidano oggi il raffreddamento computerizzato del corpo umano.
1990-2000: le miscele sostituiscono il pensiero basato su un solo agente
Nessun singolo agente crioprotettore ottimizzava tutti i requisiti. I ricercatori hanno progressivamente combinato agenti penetranti, in modo che ciascuno contribuisse senza raggiungere la propria concentrazione peggiore.
Le soluzioni veicolo controllavano ioni, pH e condizioni osmotiche. I polimeri non penetranti influenzavano l'acqua tissutale e il comportamento vascolare.
Gli inibitori sintetici del ghiaccio agivano sulla nucleazione e sulla crescita eterogenea del ghiaccio, riducendo la dipendenza dalla sola concentrazione dell'agente crioprotettore.
Soluzioni come VS55 e, più tardi, M22 rappresentarono un'ingegneria di sistema: più agenti, inibitori del ghiaccio e una chimica veicolo studiata con cura, abbinati a protocolli definiti di perfusione e controllo termico.
Una rassegna del 2004 sulla vitrificazione degli organi descrive i progressi ottenuti nella riduzione della tossicità, nel danno da raffreddamento, nel controllo della nucleazione e nella perfusione degli organi.
Il progresso importante non fu la scomparsa della tossicità, ma il fatto che i ricercatori impararono a distribuirne il peso tra chimica, tempo e temperatura.
Esperimenti sul rene di coniglio: importanti, ma facili da sopravvalutare
Il lavoro sul rene di coniglio dimostrò che un organo di mammifero vascolarizzato poteva essere caricato con una soluzione di vitrificazione complessa, raffreddato fino allo stato vetroso, riscaldato e trapiantato.
Un rene, secondo quanto riportato, sostenne da solo le funzioni renali di un coniglio per un periodo prolungato.
Quel risultato conta perché segnò il passaggio da campioni microscopici alla funzione di un intero organo. Non stabilì però una procedura clinica affidabile.
La letteratura successiva osserva che il successo del trapianto a lungo termine non fu ottenuto in modo riproducibile. La distribuzione, la tossicità e il riscaldamento convenzionale dalla superficie restarono i fattori limitanti.
Questo è lo stato corretto delle conoscenze: una prova di principio significativa, con un problema di riproducibilità e di scala.
2015: la qualità della conservazione diventa visibile a livello sinaptico
La crioconservazione stabilizzata con aldeidi ha combinato fissazione chimica, perfusione con agenti crioprotettori e vitrificazione in cervelli di coniglio e di maiale.
Lo studio del 2015 riportò membrane, sinapsi, vescicole, mielina e strutture intracellulari nitide dopo il riscaldamento e la preparazione per la microscopia elettronica.
Dimostrò che un'eccellente ultrastruttura neurale poteva sopravvivere a un ciclo di conservazione senza ghiaccio anche in cervelli di grandi dimensioni.
Non dimostrò un recupero funzionale vitale. La fissazione con aldeidi lega chimicamente tra loro le molecole biologiche in modo intenzionale ed è incompatibile con il ripristino ordinario della funzione vitale.
L'esperimento rispose quindi a una domanda strutturale, non alla domanda completa sulla rianimazione.
Il suo contributo più ampio fu metodologico: la qualità della conservazione va valutata ispezionando le strutture di interesse, non limitandosi a osservare che un campione ha un aspetto vetroso.
2023: il nanoriscaldamento risolve il problema del riscaldamento nei reni di ratto
Il raffreddamento è solo metà della crioconservazione reversibile. Il riscaldamento è spesso la parte più difficile.
Se il riscaldamento è troppo lento, il ghiaccio può crescere durante la devitrificazione. Se il calore arriva soprattutto dalla superficie, i gradienti termici possono fratturare l'organo.
Il nanoriscaldamento affronta entrambi i problemi distribuendo nanoparticelle di ossido di ferro nel sistema vascolare e riscaldandole con un campo magnetico a radiofrequenza alternata.
Nel 2023, i ricercatori hanno vitrificato reni di ratto, conservati fino a 100 giorni, poi nanoriscaldati e trapiantati.
I reni recuperati hanno ripristinato una funzione renale vitale nei riceventi privi di reni propri, durante il periodo di osservazione riportato.
Il risultato non dipese soltanto dal riscaldamento: il team passò a una formulazione meno tossica e modellò il caricamento dell'agente crioprotettore per migliorare la concentrazione nei tessuti.
È una lezione ricorrente nella storia della vitrificazione: risolvere un collo di bottiglia ne rivela il successivo, e un recupero riuscito richiede l'intera catena di passaggi.
2024-2026: sistemi fisici più grandi e tessuto neurale funzionante
Nel 2024, i ricercatori hanno riportato una vitrificazione fisica su scala di organo umano in sistemi da 0,5 a 3 litri.
Hanno combinato termometria interna, annealing, raffreddamento controllato e ispezione con micro-TC, e hanno inoltre dimostrato il nanoriscaldamento in volumi fino a 2 litri.
Le dimostrazioni su scala maggiore sono state soprattutto di natura fisica. Evitare ghiaccio e fratture visibili è necessario, ma non dimostra il recupero biologico di un organo delle dimensioni umane.
Nel 2026, uno studio su PNAS ha riportato un recupero funzionale a breve termine di tessuto ippocampale di topo adulto dopo vitrificazione e riscaldamento.
Lo studio ha misurato morfologia, reattività mitocondriale, eccitabilità neuronale, trasmissione sinaptica e potenziamento a lungo termine.
Riguardava fette di cervello di topo e preparazioni di cervello intero a basso rendimento, non un cervello umano. Il suo significato è più circoscritto, ma resta rilevante.
Ha mostrato che il tessuto neurale di un mammifero adulto può recuperare funzioni elettrofisiologiche dopo che la mobilità molecolare si è arrestata in uno stato vetroso.
La biostasi umana eredita questa scienza in condizioni più difficili
Gli esperimenti di conservazione degli organi partono da tessuto sano, tempistiche controllate e un accesso pianificato al sistema vascolare.
La biostasi umana comincia dopo la morte legale. Malattia, ischemia calda, coagulazione, edema, trasporto e malattie vascolari possono tutti compromettere la distribuzione dell'agente crioprotettore.
L'obiettivo immediato è la conservazione strutturale in vista di una possibile riparazione futura, non un trapianto reversibile nell'immediato.
Questa differenza è il motivo per cui i risultati di laboratorio non possono essere trasferiti direttamente ad affermazioni sui pazienti.
Come Tomorrow.bio ha adattato la vitrificazione alle condizioni sul campo
Tomorrow.bio ha trasferito la perfusione crioprotettiva a corpo intero su ambulanze specializzate. La procedura può cominciare vicino al paziente, invece di attendere il trasporto in Svizzera.
Questo modifica un fattore importante che la chimica non può riparare: la durata dell'ischemia prima della perfusione.
Il protocollo attuale usa una chimica a base di soluzione VM-1, adattata alla crioprotezione sul campo e al successivo trasporto su ghiaccio secco.
Un programma di ricerca della EBF ha testato VM-1 in condizioni post mortem simulate, comprese tre ore di ischemia calda.
Il programma ha misurato indice di rifrazione venoso, tempo di perfusione, variazione di peso, restringimento del cervello e formazione di ghiaccio, testando al contempo modifiche al perfusato e alla procedura.
Questa è la frontiera pratica per i casi umani: non se una soluzione ideale possa vitrificare, ma quanto bene si possa perfondere un paziente ischemico reale.
La misurazione è diventata parte della procedura
Le prime ricerche sulla vitrificazione stabilivano spesso il successo tramite trasparenza, calorimetria, diffrazione a raggi X, sopravvivenza o funzione dopo il riscaldamento.
La biostasi umana non può usare il recupero funzionale come traguardo attuale. Ha quindi bisogno di misure non distruttive e campionate della qualità della conservazione.
Tomorrow.bio sottopone ogni paziente a TC alla stessa temperatura dell'azoto liquido, per stimare la distribuzione dell'agente crioprotettore e individuare ghiaccio o difetti macroscopici in condizioni standardizzate.
Con un consenso separato, microcampioni di tessuto neurale possono sostenere una valutazione al microscopio elettronico di membrane, sinapsi e ultrastruttura locale.
Questi metodi e i loro limiti sono descritti nelle procedure di controllo qualità della biostasi.
La misurazione cambia lo sviluppo stesso della procedura. Quando un difetto diventa visibile e confrontabile tra i casi, la chimica e il protocollo possono essere modificati per correggerlo in modo mirato.
Cosa è migliorato, e cosa resta da risolvere
La vitrificazione moderna ha ottenuto diversi risultati che il congelamento delle origini non poteva raggiungere:
- conservazione senza ghiaccio di molte cellule, embrioni e piccoli tessuti;
- recupero funzionale di organi animali vitrificati in esperimenti definiti;
- conservazione strutturale a livello sinaptico in cervelli di mammifero fissati;
- raffreddamento e annealing computerizzati di sistemi più grandi;
- riscaldamento volumetrico tramite tecnologie come il nanoriscaldamento;
- metodi di TC e microscopia elettronica per misurare i risultati reali della conservazione.
Non ha ancora prodotto una crioconservazione reversibile del corpo umano intero.
I problemi che restano da risolvere comprendono l'ischemia post mortem, la perfusione disomogenea, la tossicità dell'agente crioprotettore, gli effetti della barriera emato-encefalica, i gradienti termici a corpo intero, la prevenzione delle fratture e un riscaldamento uniforme e sicuro.
Anche una conservazione strutturale riuscita lascerebbe aperti i problemi futuri della riparazione, della rianimazione e della cura della causa originaria del decesso.
Queste distinzioni sono approfondite nell'articolo sulle sfide tecniche per la crioconservazione reversibile.
In sintesi: la vitrificazione è migliorata grazie a crioprotettori più efficaci, alla perfusione, al controllo del ghiaccio, al raffreddamento, al riscaldamento e alla misurazione strutturale. Alcuni problemi sono risolti su piccola scala, mentre la reversibilità sull'intero corpo umano resta un problema aperto.
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