Refroidissement jusqu'à des températures cryogéniques

La partie dramatique d’une cryoconservation – la standby, l’intervention chirurgicale, l’application de l’antigel – se déroule en quelques heures. Ce qui suit, c’est la partie dont personne ne fait de film : une baisse lente et surveillée de la température qui peut durer de quelques jours à plusieurs semaines. On serait tenté de considérer cela comme une simple question de logistique, un trajet tranquille entre la table d’opération et la cuve de stockage. Ce n’est pas le cas. C’est lors de ce refroidissement que la vitrification s’achève réellement, et c’est là qu’une erreur commise à la hâte peut discrètement réduire à néant tout ce que l’intervention vient d’accomplir.

La tâche à accomplir au cours de cette phase est d’une simplicité trompeuse à décrire, mais véritablement difficile à réaliser : faire passer un corps imprégné de cryoprotecteur d’une température légèrement supérieure au point de congélation jusqu’à -196 °C sans que les contraintes thermiques ne le détruisent. Pour y parvenir, il faut procéder lentement, de manière régulière et en respectant scrupuleusement une température bien précise.

La température qui importe vraiment, c'est la température de transition vitreuse

Une fois que l'intervention de perfusion a remplacé la majeure partie de l'eau contenue dans le corps par des agents cryoprotecteurs, le tissu est prêt à subir une vitrification plutôt qu'une congélation. C'est précisément là que réside tout l'intérêt de cette technique : la congélation forme des cristaux de glace qui détruisent les cellules, tandis que la vitrification transforme le tissu en verre, un solide dépourvu de cristaux et de fragments susceptibles de se dilater.

Cette transition d’un liquide visqueux vers un verre solide se produit à la température de transition vitreuse, aux alentours de -130 °C. Au-dessus de cette température, le tissu cryoprotégé se présente sous la forme d’un sirop capable de s’écouler et de se réorganiser. En dessous, le mouvement moléculaire a tellement ralenti que la structure se fige et reste inchangée. C’est la transition vitreuse, et non la température de stockage bien plus basse, qui détermine si l’on obtient ou non un verre. Tout notre processus de refroidissement est organisé de manière à franchir cette limite sans problème.

Pourquoi les rythmes lents, voire réguliers, sont plus rapides

Si l'on refroidit un objet solide de manière inégale, sa surface se contracte tandis que son intérieur reste chaud et plus volumineux. Ce décalage génère une contrainte mécanique et, en dessous de la température de transition vitreuse — où le matériau est cassant plutôt qu'élastique —, une contrainte suffisante provoque une fracture : de véritables fissures qui traversent le tissu. C'est l'équivalent cryogénique de verser de l'eau bouillante dans un verre froid et de le voir se fendre, sauf que le verre, ici, c'est le cerveau d'une personne.

La stratégie consiste à refroidir lentement et uniformément afin que l'ensemble du corps reste à une température proche tout au long de la descente, en limitant ainsi les gradients thermiques. Un refroidissement rapide fait gagner du temps dont le patient n’a plus besoin, mais entraîne en contrepartie des fractures. La descente à travers la transition vitreuse est donc délibérément progressive, et la vitesse est surveillée plutôt que devinée. Un bref maintien près de la transition vitreuse peut également permettre aux contraintes accumulées de se relâcher avant que le tissu ne devienne complètement cassant, de la même manière que l’on pourrait laisser une structure tendue se stabiliser avant de la soumettre à une charge supplémentaire. Rien de tout cela ne change la destination ; cela détermine simplement si le patient y arrive intact.

Pourquoi continuons-nous à descendre jusqu'à -196 °C ?

Si le verre se forme à environ -130 °C, pourquoi descendre encore d’une soixantaine de degrés ? Pour disposer d’une marge de sécurité et d’un thermostat « gratuit ». À -196 °C, le point d’ébullition de l’azote liquide, le temps biologique s’arrête effectivement et la température de stockage se régule d’elle-même : tant qu’il y a de l’azote liquide dans le réservoir, le contenu reste exactement à -196 °C, sans compresseur et sans dépendre du réseau électrique. Conserver les tissus bien en dessous de la transition vitreuse permet de les maintenir au cœur de la zone stable, loin de toute température à laquelle le verre pourrait se ramollir ou la glace pourrait refaire son apparition. La logique complète derrière ce chiffre est une histoire à part entière, racontée dans l’article « Pourquoi la cryoconservation se fait à -196 °C ».

Le problème, c’est que plus on descend en dessous de la température de transition vitreuse, plus le verre devient fragile et plus le risque de fracture augmente. C’est donc cette descente profonde de -130 °C à -196 °C qui constitue la phase la plus délicate de tout le processus de refroidissement ; elle s’effectue lentement, sur plusieurs jours voire plusieurs semaines, précisément parce que le matériau est alors à son niveau de fragilité maximal.

L'option à température intermédiaire

Il existe un moyen de sacrifier un peu de stabilité pour réduire considérablement les fractures, et cette technique porte un nom : le stockage à température intermédiaire, ou ITS. Au lieu de conserver le patient à la température maximale de -196 °C, l’ITS le maintient à une température plus proche de la transition vitreuse, soit environ -140 °C, ce qui est bien en dessous de cette transition mais nettement plus chaud que l’azote liquide.

Le raisonnement est simple. La majeure partie du risque de fissuration provient des forts gradients thermiques et de la fragilité du verre aux profondeurs les plus froides. En restant juste en dessous de la transition vitreuse, le verre reste solide et stable tout en réduisant considérablement les contraintes mécaniques susceptibles de le fissurer. L’inconvénient est qu’il est plus difficile de maintenir une température intermédiaire précise que de laisser un liquide en ébullition se stabiliser à -196 °C ; l’ITS nécessite donc un matériel de stockage plus sophistiqué. Il s’agit d’un véritable compromis technique, et non d’une solution miracle, et c’est l’un des domaines d’exploration actuels pour améliorer la qualité de la conservation dans les installations de stockage à long terme.

Le lien entre la chirurgie et le Dewar

Avec un peu de recul, on comprend mieux que la phase de refroidissement est en quelque sorte un pont. D’un côté se trouve la table d’opération, où l’antigel a été injecté. De l’autre, le vase Dewar de stockage, où le « patient » attendra, peut-être pendant des siècles. Ce pont est la seule partie du parcours où le tissu traverse la dangereuse transition vitreuse pour entrer dans le froid extrême qui le rend cassant, et c’est cette partie qui détermine si le verre qui se forme sera intact ou fissuré.

C’est pourquoi nous considérons la phase de refroidissement comme une procédure à part entière, surveillée et documentée, plutôt que comme un simple détail du transport. La courbe de refroidissement est intégrée au dossier médical permanent du patient et fait partie des éléments évalués dans le cadre de nos procédures de contrôle qualité. Une phase de refroidissement sans incident est un travail invisible, le genre de travail que personne ne remarque précisément parce que tout s’est déroulé sans accroc.

La vitrification ne s'achève pas sur la table d'opération ; elle s'achève au cours de la descente lente et prudente vers la transition vitreuse, où tout l'art consiste à procéder avec douceur.

Le refroidissement est une méthode, pas un objectif, et c’est pendant la phase de refroidissement que cette méthode est la plus exigeante. Allez-y doucement, maintenez un rythme régulier, respectez la transition vitreuse, laissez une marge généreuse en dessous de celle-ci, et le patient franchira le cap entre l’intervention chirurgicale et la conservation sous la forme d’un verre intact, prêt à attendre.

Pour en savoir plus

• La procédure de perfusion et de cryoprotection
• Les dewars modernes de stockage cryogénique et l'ITS
• La différence entre la congélation et la vitrification
• Pourquoi la cryoconservation s'effectue-t-elle à -196 °C ?