Ecco un fatto davvero imbarazzante su come conserviamo i pazienti oggi: la temperatura che rende la conservazione economica e affidabile, -196 °C, è più bassa di quella che proteggerebbe al meglio il tessuto. Non raffreddiamo i pazienti fino a quella temperatura perché lo impone la fisica. Lo facciamo semplicemente perché l’azoto liquido è proprio a quella temperatura, ed è l’unica cosa che abbiamo a disposizione. Questo articolo parla del divario tra ciò che è pratico e ciò che è ottimale, e del metodo di conservazione sperimentale che cerca di colmarlo.
Tomorrow.bio studia Tomorrow.bio nuovi modi per migliorare la conservazione. Le fasi iniziali sono già ben perfezionate: i team SST eseguono l’unica procedura professionale di crioprotezione sul campo dell’intero corpo disponibile, i crioprotettori all’avanguardia limitano il danno cellulare durante il raffreddamento e l’azoto liquido garantisce un ambiente di conservazione molto stabile. Ma si può ancora migliorare, e una questione ancora aperta è proprio la temperatura di conservazione.
Il problema non è lo spazio di archiviazione, ma il trasferimento dei dati verso lo spazio di archiviazione
La maggior parte delle persone crioconservate viene conservata nell’azoto liquido a -196 °C. Il metodo è economico, sostenibile, non consuma elettricità ed è facile da gestire, visto che basta ricaricare il serbatoio più o meno una volta alla settimana. Allora, qual è il problema?
Durante la crioconservazione, i pazienti entrano in uno stato vitrificato, simile al vetro, a circa -130 °C. Dopodiché vengono raffreddati ulteriormente fino a -196 °C, la temperatura naturale dell’azoto liquido, dove la loro temperatura rimane poi costante. Il problema non è la permanenza a -196 °C, ma il passaggio da -130 °C a -196 °C.
A dirla tutta, a -196 °C la conservazione non è significativamente migliore rispetto a -130 °C. L’azoto liquido si trova semplicemente a una temperatura compatibile con la crioconservazione; semmai, sarebbe più pratico se la sua temperatura fosse più vicina al punto di transizione vetrosa, pur rimanendo al di sotto di esso. Un raffreddamento uniforme riduce al minimo lo stress termico mentre il tessuto scende sotto la temperatura di vetrificazione, e mantenere la temperatura vicino alla transizione vetrosa per un po’ subito dopo la vetrificazione permette allo stress di allentarsi prima che il raffreddamento continui. Al contrario, scendere fino a -196 °C provoca la frattura del tessuto. Queste fratture non distruggono necessariamente le informazioni neuroanatomiche fondamentali, ma complicano il recupero futuro, il che le rende una delle vere sfide tecniche per una conservazione di alta qualità.
Perché il raffreddamento fa rompere il vetro
Il meccanismo è semplice fisica. Le molecole vibrano e questa vibrazione determina un volume caratteristico a una data temperatura; se raffreddi un oggetto, questo si contrae. È la contrazione termica. Quando un corpo vetrificato si raffredda, la sua parte interna, più calda, si raffredda e si restringe leggermente più velocemente rispetto al guscio esterno. [1] L’interno e l’esterno sono legati tra loro, quindi la differenza di contrazione crea una tensione. Superato un certo punto, il solido vetroso allevia quella tensione nell’unico modo in cui un solido fragile può farlo: fratturandosi. È la scala a determinare quanto sia grave il fenomeno. Pochi millilitri di tessuto o un singolo embrione raggiungono l’equilibrio abbastanza velocemente da non formare un gradiente significativo, quindi campioni del genere arrivano a -196 °C intatti. Il corpo umano mantiene un gradiente che si estende per decine di centimetri per ore, ed è per questo che la frattura si verifica alla nostra scala e non in laboratorio. Più ti spingi al di sotto della transizione vetrosa, più si accumula lo squilibrio di contrazione.
Conservazione a temperatura intermedia: interrompi il raffreddamento prima
La soluzione deriva direttamente dalla diagnosi. Se la maggior parte delle fratture si verifica durante il raffreddamento da -130 °C a -196 °C, allora basta raffreddare lentamente attraverso la transizione vetrosa e fermarsi prima, mantenendo il paziente più vicino al punto di vetrificazione. È esattamente quello che fa la conservazione a temperatura intermedia (ITS), che prende il nome da una temperatura di conservazione che si colloca tra la vetrificazione e l’azoto liquido, intorno ai -140 °C. Lo stress termico è minore quando il raffreddamento oltre la transizione vetrosa viene interrotto prima, e i dati passati mostrano che il rischio di danni aumenta quanto più velocemente viene raffreddato il tessuto. [2] In teoria, l’ITS è il metodo di conservazione migliore.
Allora, perché non è uno standard? Un'analisi onesta dei costi e dei benefici
Perché una migliore conservazione non è l'unica variabile, ed è qui che la calibrazione ha la meglio sull'entusiasmo. L'ITS non è molto usato al di fuori della ricerca, per ragioni più pratiche che teoriche, e queste si sommano:
- Una riserva di azoto molto più ridotta. Un dewar tradizionale a -196 °C viene tenuto quasi pieno, con oltre 1000 litri, sufficienti a garantire la conservazione per mesi prima che si svuoti. Il rifornimento settimanale è una routine, non una scadenza. Un tipico dewar ITS contiene solo circa 120 litri sul fondo, sufficienti al massimo per circa 5 giorni a -140 °C. Meno riserva significa meno margine di errore.
- Maggiore consumo, minore capacità. I dewars ITS consumano circa il doppio dell’azoto liquido rispetto ai modelli più freddi. Inoltre, offrono solo circa un terzo della capacità di contenimento. Gran parte dell’interno deve rimanere vuota, perché quello è lo spazio di vapore in cui si trova il paziente. Come i dewars standard, possono ricaricarsi automaticamente, ma richiedono più risorse e controlli più frequenti per mantenere una temperatura stabile.
- Altri modi per andare alla deriva. Mantenere una temperatura intermedia precisa è intrinsecamente più difficile che lasciare un recipiente al punto di ebollizione fisso dell’azoto. Le fluttuazioni di temperatura potenzialmente dannose sono più probabili, il che rende l’ITS, così come è attualmente realizzato, l’opzione meno affidabile e meno sicura.
Questi inconvenienti si possono risolvere, ma farlo fa lievitare notevolmente i costi di manutenzione dello stoccaggio. Quindi il settore si trova di fronte a un vero e proprio compromesso. In linea di principio, il metodo riduce la fratturazione. In pratica, però, al momento aumenta il rischio di un’oscillazione di temperatura. Un’oscillazione mette a rischio l’intero sistema, non solo un singolo piano di frattura. Per ora, vincono i classici contenitori Dewar a -196 °C. Sono stabili e hanno un’enorme riserva di azoto. In un secolo, il parametro che conta di più non è il danno teorico più basso, ma la probabilità più bassa di un guasto catastrofico.
La conservazione a temperatura intermedia sacrifica un po’ di integrità dei tessuti in cambio di un margine di sicurezza minore contro le catastrofi, e finché quel margine non si riduce, il posto più sicuro per un paziente rimane comunque il freddo profondo, che richiede solo un rabbocco.