La parte più drammatica della crioconservazione – standby, l’intervento, l’antigelo – finisce nel giro di poche ore. Quello che segue è la parte su cui nessuno fa un film: un lento abbassamento della temperatura, monitorato costantemente, che può durare da giorni a settimane. Si è tentati di pensare che sia solo una questione logistica, il tranquillo tragitto dal tavolo operatorio al serbatoio di conservazione. Ma non è così. È proprio durante il raffreddamento che la vitrificazione si completa davvero, ed è lì che un errore commesso in fretta può silenziosamente mandare all’aria tutto ciò che l’intervento ha appena ottenuto.
Il compito di questa fase sembra semplicissimo a dirlo, ma in realtà è davvero difficile da portare a termine. Devi portare un corpo pieno di crioprotettore da una temperatura appena sopra lo zero fino a -196 °C. E devi farlo senza che lo stress termico lo distrugga. Per farlo bene, devi procedere lentamente, in modo uniforme e rispettando una temperatura ben precisa.
La temperatura che conta davvero è quella di transizione vetrosa
Dopo che l'intervento di perfusione ha sostituito gran parte dell'acqua presente nel corpo con agenti crioprotettivi, il tessuto è pronto per la vitrificazione anziché per il congelamento. La differenza è proprio il fulcro di questa tecnica: il congelamento forma cristalli di ghiaccio che lacerano le cellule, mentre la vitrificazione trasforma il tessuto in uno stato simile al vetro, un solido privo di cristalli e di frammenti espansivi.
Quella transizione da un liquido denso a un vetro solido avviene alla temperatura di transizione vetrosa, intorno ai -130 °C. Al di sopra di essa, il tessuto crioprotetto è uno sciroppo che può ancora scorrere e riorganizzarsi. Al di sotto, il movimento molecolare si è ridotto a tal punto che la struttura si blocca e rimane stabile. La transizione vetrosa è la linea che determina se si ha o meno uno stato simile al vetro. La temperatura di conservazione, molto più bassa, non lo è. Tutto il nostro processo di raffreddamento è organizzato in modo da superare quella linea in modo netto.
Perché i ritmi lenti e regolari battono quelli veloci
Se raffreddi un oggetto solido in modo non uniforme, la parte esterna si contrae mentre quella interna è ancora calda e più espansa. Questo squilibrio crea una tensione meccanica e, al di sotto della temperatura di transizione vetrosa – dove il materiale è fragile anziché elastico – una tensione sufficiente provoca la frattura: vere e proprie crepe che attraversano il tessuto. È come versare acqua bollente in un bicchiere freddo e vederlo rompersi, solo che in questo caso il bicchiere è il cervello di una persona.
La strategia consiste nel raffreddare lentamente e in modo uniforme, in modo che l’intero corpo rimanga a una temperatura pressoché costante durante la discesa, mantenendo bassi i gradienti termici. Un raffreddamento rapido fa risparmiare tempo di cui il paziente non ha più bisogno, ma in cambio provoca fratture. Quindi la discesa attraverso la transizione vetrosa è volutamente graduale, e la velocità viene monitorata anziché stimata. Una breve pausa vicino alla transizione vetrosa può anche permettere alle tensioni accumulate di allentarsi prima che il tessuto diventi completamente fragile, proprio come faresti con una struttura tesa prima di caricarla ulteriormente. Una breve pausa vicino alla transizione vetrosa può anche permettere alle tensioni accumulate di allentarsi prima che il tessuto diventi completamente fragile, la stessa fase di ricottura che usano i vetrai per eliminare la tensione dal vetro durante il raffreddamento. Niente di tutto questo cambia la destinazione; cambia solo se il paziente arriva intatto.
Perché continuiamo ad arrivare fino a -196 °C
Se lo stato vetroso si forma a circa -130 °C, perché continuare ad abbassare la temperatura di altri sessanta e rotti gradi? Per avere un margine di sicurezza e per avere un termostato “gratis”. A -196 °C, il punto di ebollizione dell’azoto liquido, il tempo biologico si ferma di fatto. Anche la temperatura di conservazione si regola da sola. Finché c’è azoto liquido nel serbatoio, il contenuto rimane esattamente a -196 °C. Niente compressore, nessuna dipendenza dalla rete elettrica. Conservare i tessuti ben al di sotto della transizione vetrosa li mantiene in profondità all’interno della zona stabile. Lontano da qualsiasi temperatura in cui lo stato vetroso potrebbe ammorbidirsi o il ghiaccio potrebbe insinuarsi di nuovo. La logica completa di quel numero è una storia a sé stante, raccontata nell’articolo “Perché la crioconservazione avviene a -196 °C”.
Il problema è questo: più ti avvicini alla temperatura di transizione vetrosa, più lo stato vetroso diventa fragile. E con esso cresce anche il rischio di frattura. Quindi il forte abbassamento da -130 °C fino a -196 °C è la fase più delicata dell’intero processo di raffreddamento, che viene effettuato lentamente nell’arco di giorni o settimane proprio perché il materiale è ormai al massimo della sua fragilità.
L'alternativa a temperatura intermedia
C'è un modo per sacrificare un po' di stabilità in cambio di una riduzione significativa delle fratture, e ha un nome: lo stoccaggio a temperatura intermedia, o ITS. Invece di conservare il paziente alla temperatura massima di -196 °C, l'ITS lo mantiene più vicino alla transizione vetrosa, a circa -140 °C, ben al di sotto della transizione vetrosa ma a una temperatura molto più alta rispetto all'azoto liquido.
La logica è semplice. La maggior parte del rischio di fratturazione deriva dagli elevati gradienti termici e dalla fragilità del freddo più profondo. Rimanere appena al di sotto della temperatura di transizione vetrosa mantiene il tessuto solido e stabile. Inoltre, riduce drasticamente lo stress meccanico che lo fa rompere. Il rovescio della medaglia è che mantenere una temperatura intermedia precisa è più difficile che lasciare che un liquido bollente si stabilizzi a -196 °C, quindi l’ITS richiede un’attrezzatura di conservazione più sofisticata. È un vero e proprio compromesso ingegneristico, non una soluzione miracolosa, ed è una delle frontiere attive nel miglioramento della qualità della conservazione negli impianti di stoccaggio a lungo termine.
Il ponte tra la sala operatoria e il dewar
Se ci pensi bene, il periodo di raffreddamento va visto come un ponte. Da una parte c’è il tavolo operatorio, dove è stato iniettato l’antigelo. Dall’altra c’è il dewar di conservazione, dove il “paziente” aspetterà, magari per secoli. Il ponte è l’unica parte del percorso in cui il tessuto attraversa la pericolosa transizione vetrosa ed entra nel freddo profondo e fragile. È la parte che decide se lo stato vetroso che si forma sarà integro o incrinato.
Ecco perché consideriamo il raffreddamento come una procedura a sé stante, monitorata e documentata, piuttosto che un semplice dettaglio del trasporto. L’andamento della curva di raffreddamento entra a far parte della cartella clinica del paziente ed è uno degli aspetti valutati nelle nostre procedure di controllo qualità. Un raffreddamento perfetto è un lavoro invisibile, di quelli che nessuno nota proprio perché non c’è stato nessun intoppo.
La vetrificazione non finisce sul tavolo operatorio; si completa nella lenta e attenta discesa attraverso la transizione vetrosa, dove procedere con delicatezza è l’essenza stessa del lavoro.
Il raffreddamento è il metodo, non l’obiettivo, ed è proprio durante la fase di raffreddamento che questo metodo richiede il massimo impegno. Procedi con calma, mantieni un ritmo costante, rispetta la transizione vetrosa, lascia un ampio margine al di sotto di essa, e il campione passerà dall’intervento alla conservazione come un vetro intatto, pronto per l’attesa.